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蛋白质透析

概述

在蛋白质和核酸研究中，通常需要去除可能干扰后续实验步骤的小分子量物质，或将蛋白质样品更换到不同的缓冲系统中，以便进行电泳、离子交换或亲和层析等下游应用。透析是一种有效的方法，可用于大分子样品（如蛋白质）的污染物去除和缓冲液交换。

什么是透析？

透析是一种基于选择性被动扩散的分离技术。它通过半透膜来实现：将样品（含有大分子和需要去除的小分子）和透析液（缓冲溶液，通常是样品体积的200至500倍）放置在膜的两侧。

• 半透膜的工作原理： 透析膜是一种含有各种大小孔隙的薄膜（通常是再生纤维素）。
  • 大分子：由于其尺寸大于膜孔，无法穿过膜，因此被保留在样品侧。
  • 小分子和缓冲盐：可以自由穿过膜，从而实现样品中这些小分子浓度的降低。

通过定期更换透析液缓冲液，可以持续清除样品中不再存在的小分子，并促使更多污染物扩散到透析液中，最终将样品中小型污染物的浓度降低到可接受或可忽略的水平。

透析原理：扩散

透析基于扩散原理。扩散是溶液中分子因热运动和随机运动而产生的一种过程，导致分子从高浓度区域向低浓度区域净移动，直至达到平衡。

在透析过程中：

• 样品室中不需要的小分子会通过半透膜扩散到透析液中。
• 大分子由于无法穿过膜孔，会保留在样品室中。
• 小分子则自由扩散，并在整个溶液体积中达到平衡，从而有效降低样品中这些小分子的浓度。

如果每次更换透析液缓冲液前都允许透析达到平衡，膜保留物质的纯化因子等于缓冲液体积与样品体积之比。例如，1毫升样品与200毫升透析缓冲液进行透析，平衡后可使不需要的可透析物质浓度降低200倍。多次更换缓冲液可以指数级地进一步降低污染物水平。

透析性能与影响因素

完成透析所需的时间和效率受多种因素影响：

1. 温度：热量影响分子的热力学，增加温度会加速扩散。因此，透析在室温下比在4°C下进行得更快。选择温度时，应考虑目标分子的热稳定性。
2. 分子浓度：扩散速率与分子浓度成正比。浓度越高，分子接触透析膜并扩散到另一侧的概率越大。
3. 分子量：扩散速率与分子量成反比。分子量越大，溶液中分子的移动速率越低，即使分子足够小能通过孔隙，扩散的几率也会降低。
4. 膜的表面积和厚度：
   • 表面积：透析速率与膜的表面积成正比。样品在膜表面铺展得越平坦，透析速度就越快，因为样品中的分子会更接近膜，并有更高比例的分子直接接触膜。
   • 厚度：透析速率与膜的厚度成反比。实验室常用膜的厚度通常为0.5至1.2密耳（12至30微米），兼顾扩散速率和结构完整性。高性能透析产品（如Thermo Scientific Slide-A-Lyzer透析盒）旨在最大限度地提高表面积与体积比。
5. 搅拌：在透析过程中搅拌缓冲液可以增加扩散速率。当小分子通过膜外侧的孔隙排出时，它们会形成一个称为能斯特扩散层的微环境。在这个层中，小分子浓度较高，会减缓透析速率。有效搅拌能打破能斯特层外部的宏观环境，有助于维持驱动扩散过程所需的浓度差异。

膜分子量截留（MWCO）

分子量截留（MWCO） 描述了膜孔径，以埃（Å）为单位测量。MWCO越大，孔径越宽。MWCO定义为未能穿过透析膜的分子中最小的平均分子质量。例如，10K MWCO的膜将保留90%以上分子质量为10 kDa或更大的蛋白质。

• 膜材料：实验室透析最常用的膜由再生纤维素制成，通过铜氨法或粘胶法生产。
• 结构与孔径：溶解的纤维素被挤出成管状或片状，然后干燥。甘油常作为保湿剂添加，以防止干燥时开裂并维持所需的孔结构。3.5K、7K、10K和20K MWCO膜的孔径范围为15-50 Å。
• 特性：膜具有对称的孔结构，允许小分子双向迁移。再生纤维素是亲水性的，容易在缓冲液中饱和，为水溶液中的透析提供均匀的介质。膜的扩散能力与亲水性直接相关。

蛋白质样品透析的典型程序

透析过程的驱动力是样品和透析缓冲溶液组成上的浓度差异。高缓冲液与样品体积比有助于维持浓度梯度。透析液缓冲液更换的次数和透析时间也影响透析结果。由于每个样品都有变量，无法提供通用的透析程序，以下仅为一般指导。目标是将低分子量化合物的浓度降低到不干扰后续实验步骤的水平。

典型步骤如下：

1. 根据说明预湿或准备膜。
2. 将样品装入透析管或设备中。
3. 在室温下透析1至2小时。
4. 更换透析缓冲液，再透析1至2小时。
5. 更换透析缓冲液，并在4°C下过夜透析。

重要提示：为获得最佳结果，请使用至少是样品体积100倍以上的透析缓冲液（透析液）。